TY - JOUR ID - TI - Production of 7-methylxanthine from Theobromine by Metabolically Engineered E. coli انتاج 7-مثيل زانثين من الثيوبرومين بواسطة بكتريا القولون المعدلة وراثيا AU - Khalid H.R. Algharrawi خالد حسين رحيمة الغراوي AU - Mani Subramanian ماني سوبرامانيان PY - 2020 VL - 21 IS - 3 SP - 19 EP - 27 JO - Iraqi Journal of Chemical and Petroleum Engineering المجلة العراقية للهندسة الكيمياوية وهندسة النفط SN - 19974884 26180707 AB - In this work, a novel biocatalytic process for the production of 7-methylxanthines from theobromine, an economic feedstock has been developed. Bench scale production of 7-methlxanthine has been demonstrated. The biocatalytic process used in this work operates at 30 OC and atmospheric pressure, and is environmentally friendly. The biocatalyst was E. coli BL21(DE3) engineered with ndmB/D genes combinations. These modifications enabled specific N7- demethylation of theobromine to 7-methylxanthine. This production process consists of uniform fermentation conditions with a specific metabolically engineered strain, uniform induction of specific enzymes for 7-methylxanthine production, uniform recovery and preparation of biocatalyst for reaction and uniform recovery of pure 7-methylxanthine. Many E. coli BL21(DE3) strains metabolically engineered with single and/or multiple ndmB/D genes were tested for catalytic activity, and the best strains which had the higher activity were chosen to carry out the N-demethylation reaction of theobromine. Strain pBD2dDB had the highest activity for the production of 7-methylxanthine from theobromine. That strain was used to find the optimum amount of cells required to achieve complete conversion of theobromine to 7-methylxanthine within two hours. It was found that the optimum concentration of pBD2dDB strain to achieve 100% conversion of 0.5 mM theobromine to 7-methylxanthine was 5 mg/mL. The cell growth of pBD2dDB strain was studied using two different growth media, (Luria-Bertani Broth and Super Broth). Super broth was found to be the best medium to produce the highest amount of cell paste (1.5 g). Subsequently, the process was scaled up in which 2 L reaction volume was used to produce 7-methylxanthine (100% conversion) from 0.5 mM theobromine catalyzed by pBD2dDB strain. The reactions was carried out at 30 oC and 250 rpm shaker speed, and the reaction medium was 50 mM potassium phosphate buffer (pH=7). 7-methylxanthines was separated by preparative chromatography with high recovery, and the product solution was collected, purified by drying at 120-140 oC for 4 hours and, recovered (127 mg). Purity of the isolated 7-methylxanthine was comparable to authentic standards with no contaminant peaks, as observed by HPLC, LC-MS, and NMR.

تناولت هذه الدراسة تطويرعملية جديدية لأنتاج 7-مثيل زانثين من الثيوبرومين باستخدام بكتريا القولون BL21(DE3) المعدلة وراثيا بمورثات ( ndmB/D) كعامل مساعد للتفاعل. الظروف التي استخدمت في عملية الانتاج هي 30 درجة مئوية عند الضغط الجوي. في البدء تم استخدام 5 سلالات من العامل المساعد وبينت النتائج ان السلالة E. coli BL21(DE3) pBD2dDB هي افضل عامل مساعد بتركيز (5 mg/mL ) لانتاج اكبر كمية من 7-مثيل زانثين بنسبة تحول (100%) في زمن حوالي ساعتين. ايضا تم دراسة نمو العامل المساعد في نوعين من ال ( media) هما ( Super Broth) و ( Lauria Broth) ووجد ان سلالة البكتريا pBD2dDB تنمو اكثر في ال ( Super Broth) حيث وصلت كميتها الى (1.5 g). بعد ذلك تم استخدام العامل المساعد في عملية اكبر لغرض انتاج اكثر من 100 ملغرام من ال 7 مثيب زانثين. استخدم 2 لتر من سائل التفاعل يحتوي 0.5 mM من الثيوبرومين في وسط 50 mM محلول فوسفات البوتاسيوم ( pH=7). التفاعل تم عند 30 درجة حرارة و 250 rpm سرعة اهتزاز الهزاز. بعد مرور حوالي ساعتين علة التفاعل تم عزل السائل الذي يحتوي على الناتج (7-مثيل زانثين) بواسطة الترشيح, ثم تم فصله بواسطة preparative chromatography حيث تم الحصول على نسبة فصل عالية. بغد ذلك تم فصل وتنقية الناتج بالتجفيف عند درجة حرارة 120-140 oC لمدة 4 ساعات. في النهاية تم الحصول على 127 ملغرام من 7-مثيل زانثين عالي النقاوة كما اثبتته فحوص ال HPLC و LC-MS و NMR. ER -