TY - JOUR ID - TI - Purification and characterization of amylase from local isolate Pseudomonas sp.SPH4 تنقية وتوصيف انزيم الاميليز من العزلة المحلية لبكتيريا الـPseudomonas sp. SPH4 AU - Hala M. Ali هالة مشعل علي AU - Ghazi M. Aziz غازي منعم عزيز PY - 2012 VL - 6 IS - 1 SP - 69 EP - 79 JO - Journal of Biotechnology Research Center مجلة مركز بحوث التقنيات الاحيائية SN - 18151140 27081370 AB - The amylase produced from local isolate Pseudomonas sp. SPH4 was purified by precipitation with 30% saturation ammonium sulphate, followed by ion-exchange chromotography using DEAE-cellulose column, and Gel filtration using Sephacryl S-300 column.The two iso-enzymes (a, b) were purified to (2.83, 3.47) times in the last step with an enzymes yields of (32.36, 76.34)% respectively. Enzyme characterization of the two iso-enzymes indicated that the optimum pH for the two iso-enzymes a and b were (7, 7.5) respectively, while the optimum pH for the iso-enzymes stability were (6.5, 7) respectively. The maximum activity for iso-enzymes (a, b) appeared at 45ºC and stable for 15 min at 30-50ºC and lost approximately 50% of it's activity at rang above 75ºC. Enzyme characterization results showed that the chlorides of silver and mercury had inhibitory effect on enzyme activity, the remaining enzyme activity for the iso-enzymes (a, b) were (46.66, 36.36)% for silver ions and (41.33, 33.63)% for mercury ions at 5 mM respectively, and (28, 28.18)% for silver ions and (25.33, 19.09)% for mercury ions at 10 mM respectively. The iso-enzymes a and b were affected by chelating agent ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) at concentration 2mM the remaining activity (45.33, 43.63)% respectively, and 5mM the remaining activity (28, 28.18)% respectivily, and these iso-enzymes (a, b) refered to metalloenzymes. The iso-enzymes (a, b) were kept their activity when treated by reducing agent (2-mercaptoethanol) at 2 mM the remaining activity (92, 92.72)% respectively, and 5 mM the remaining activity (85.3, 89.09)% respectivily. The iso-enzymes (a, b) were kept their activity when treated by phenyl methyl sulphonyl fluoride (PMSF) at concentration 1mM the remaining activity (93.33, 90.90)% respectivily,and 5 mM the remaining activity (90.66, 87.27)% respectivily, and these indicated that these iso-enzymes didnot referred to serineamylases group.

نقي انزيم الاميليز من العزلة المحلية لبكتيريا الـPseudomonas sp.SPH4 بخطوات عدة تضمنت الترسيب بكبريتات الامونيوم بنسبة اشباع 30% وتقنية كروموتوغرافيا التبادل الايوني و الترشيح الهلامي . لوحظ ظهور متناظرين للانزيم (a،b) عند خطوة التبادل الايوني باستعمال المبادل الايوني DEAE-cellulose والترشيح الهلامي بواسطة هلام Sephacryl S-300 و قد بلغ عدد مرات التنقية للمتناظرين 2.83(2.83 ،3.47 ) بحصيلة انزيمية مقدارها( 32.36 ، 76.34)% على التوالي . بينت نتائج التوصيف للمتناظرين a) ، b) ان الارقام الهيدروجينية المثلى لفعالية المتناظرين (a ، b) ضمن 7 ،7.5 على التوالي ، وتراوح الرقم الهيدروجيني الامثل لثبات المتناظرين 6.5 ، 7 على التوالي . وظهرت اعلى فعالية للمتناظرين عند درجة 45 م . واحتفظ المتناظران بكامل فعاليتهما عند حضنهما مدة 15 دقيقة في درجة حرارة (30-50)م بينما فقدا 50% من فعاليتهما عند حضنهما بدرجة حرارة اعلى من 75م . اوضحت نتائج تاثير بعض المركبات في فعالية الانزيم ان لكل من كلوريد الزئبق والفضة تاثيرا تثبيطيا واضحا في فعالية المتناظرين و لم تتجاوز الفعالية الانزيمية المتبقية لهما عن (46.66 ، 36.36)% بالنسبة لايونات الفضة و(41.33 ، 33.63)% بالنسبة لايونات الزئبق عند التركيز 5 ملي مولر، على التوالي ولم تتجاوزالفعالية الانزيمية المتبقية لهما عن (28 ، 28.18)% بالنسبة لايونات الفضة و(25.33 ، 19.09)% بالنسبة لايونات الزئبق عند التركيز 10 ملي مولر، على التوالي . وتاثيرا مثبطا للمادة الكلابية الـ (EDTA) Ethylene Diamine Tetra Acetic acid عند معاملةالمتناظرين بـ 2 ملي مولر من المادة الكلابية اذ لم تتجاوز الفعالية الانزيمية المتبقية لهما عن (45.33 ،34.63)% على التوالي ، و5 ملي مولر من المادة الكلابية اذ لم تتجاوز الفعالية الانزيمية المتبقية لهما عن (28 ، 28.18)% على التوالي مما يدل ان الانزيم من الانزيمات المعدنية (Metalloenzymes) . فضلا عن ذلك فقد احتفظ المتناظرين (a،(b بفعاليتهما تقريبا عند معاملتهما بـ 2 ملي مولرمن المركبتوايثانول 2-mercaptoethanol اذ لم تتجاوز الفعالية الانزيمية المتبقية لهما عن (92 ، 92.72)% على التوالي ، و 5 ملي مولرمن المركبتوايثانولmercaptoethanol 2-اذ لم تتجاوز الفعالية الانزيمية المتبقية لهما عن (85.3 ، 89.09)% على التوالي . واحتفظ المتناظرين a) ، (bبفعاليتها تقريبا عند معاملتهما بـ 1 ملي مولر من المركب (PMSF) phenyl methyl sulphonyl flouride اذ لم تتجاوز الفعالية الانزيمية المتبقية لهما عن (93.33 ، 90.90)% على التوالي ، و5 ملي مولر من المركب (PMSF) phenyl methyl sulphonyl flouride اذ لم تتجاوز الفعالية الانزيمية المتبقية لهما عن (90.66 ، 87.27)% على التوالي مما يؤكد عدم انتماء المتناظرين الى مجموعة الاميليزات السيرينية . ER -